Hibridizacija in situ

The hibridizacija in situ je metoda za odkrivanje kromosomskih aberacij. Določeni kromosomi so označeni s fluorescentnimi barvili in vezani na DNK sondo. Ta tehnika se uporablja za prenatalno diagnozo genskih mutacij.

Kaj je in situ hibridizacija?

V primeru hibridizacije in situ ali Fluorescenca in situ hibridizacija nukleinske kisline iz RNA ali DNK odkrijemo v določenih tkivih ali celici z uporabo molekularno genetskih metod. Običajno se ta vrsta diagnoze uporablja za odkrivanje strukturne ali numerične kromosomske nepravilnosti med nosečnostjo.

V ta namen se uporablja umetno proizvedena sonda, ki je sama sestavljena iz nukleinske kisline. Nato se z združevanjem baz veže na nukleinske kisline v organizmu. Ta vez pomeni izraz hibridizacija. Dokazi temeljijo na živi strukturi pacienta in zato ustrezajo in situ. To je treba razlikovati od metod in vitro, pri katerih odkrivanje poteka v epruveti. Metodo sta v 20. stoletju razvila znanstvenika Joe Gall in Mary Lou Pardue.

Od takrat se razvija tehnologija. Medtem ko so se takrat uporabljale radioaktivne sonde, se na primer danes uporabljajo fluorescenčne sonde s kovalentno vezjo na molekule markerjev.

Funkcija, učinek in cilji

Hibridizacija na kraju samem se običajno uporablja za odkrivanje kromosomskih aberacij, to je kromosomske anomalije, ki jih ni mogoče zaznati v kariogramu. To pomeni, da se metoda vedno uporablja, kadar je treba med nosečnostjo določiti dedne bolezni.

Ker so kromosomske aberacije težava, ki je danes ne gre podcenjevati, se uporaba metode sčasoma povečuje. Hibridizacija poteka na podlagi matičnih celic iz materine amniotske tekočine. Osnova tehnologije je vezava barvno označene sonde na dele DNK. Zahvaljujoč vezavi lahko pozneje z mikroskopom ocenimo število kopij, saj posamezne kopije oddajajo svetlobni signal in so tako vidne pod mikroskopom. Obstajajo različni postopki. Analiza poteka takoj po vezavi.

V tem primeru se uporablja fluorescentno barvilo, kot je biotin, ki je vezano neposredno na DNK sondo. Pri posredni metodi hibridizacije na kraju samem ovrednotenje ne more biti izvedeno takoj po hibridizaciji, saj se fluorescenčne snovi lahko vežejo na sondo šele po hibridizaciji. Ta posredna metoda se uporablja pogosteje kot neposredna, ker velja za občutljivejšo. Poleg kromosomsko specifičnih centrometrskih sond DNA obstajajo tudi DNK-sonde, specifične za lokus, sonde, specifične za kromosom, knjižnice DNA in primerjalne hibridizacije genoma.

Za kromosomsko numerične anomalije lahko uporabimo kromosomsko specifične centrometrske DNK sonde. To pomeni, da se uporabljajo predvsem, kadar obstaja sum podvajanih ali izbrisanih kromosomov. Lokacijsko specifične DNK sonde so še posebej primerne za odkrivanje minimalnih mutacij, ki jih v kariogramu ni mogoče zaznati. Za kromosome specifično DNK knjižnična sonda se uporablja zlasti za odkrivanje vstavkov in translokacij.

Po drugi strani je primerljiva hibridizacija genoma celovita analiza izgub in dobičkov kromosomskega materiala. Danes je hibridizacija in-situ zelo pomembna pri diagnozi različnih mutacij kromosomov.Pri diagnozi Downovega sindroma se sonde na primer vežejo na kromosom 21. V ta namen se običajno uporabljajo sonde, specifične za kromosom, ki jih lahko uporabimo, če sumimo na to bolezen.

Sum lahko nastane, na primer, če so starši že rodili otroka z boleznijo in je slika ultrazvoka nenormalna. Če namesto dvojne vezi obstaja trojna in se tako oddaja trojni barvni signal, se diagnoza šteje za potrjeno.

Tveganja, neželeni učinki in nevarnosti

Za razliko od na primer PCR je hibridizacija in situ na mestu občutno manj dovzetna za kontaminacijo. Poleg tega je čas, potreben za postopek, neizmerno krajši. Ker pa zarodki tvorijo kromosomske vzorce, preostale kromosomske porazdelitve in s tem genetskega statusa drugih celic ni mogoče razbrati iz danega vzorca.

Barvni signali se lahko tudi zaradi drugih razlogov prekrivajo ali ostanejo nevidni. Posledično je hibridizacija in situ kot diagnostično orodje med nosečnostjo razmeroma nagnjena k napakam. Lahko se pojavijo napačne diagnoze in starši se lahko odločijo proti zdravemu zarodku. Da bi zmanjšali dovzetnost za napake in situ hibridizacije, je treba hkrati pregledati vsaj dve embrionalni celici. Z vzporednim pregledom dveh celic je zdaj le zanemarljivo tveganje napačne diagnoze.

V takem primeru se starši lahko popolnoma zanesejo na diagnozo. Hibridizacija na kraju samem ni na voljo vsem nosečnicam, temveč le ženskam iz rizične skupine. Kljub temu nosečnice te vrste diagnoze na lastno željo ne zavrnejo. Nenormalni izvidi ultrazvoka ali nenormalni serum lahko spodbudi zdravnika, da ponudi diagnostični postopek. Čeprav velik del, vendar nikakor ne vsega, kromosomske aberacije lahko diagnosticiramo s pomočjo hibridizacije in situ.

Zato hibridizacije in situ ne smemo nikoli izvajati sami, ampak jo moramo vedno uporabljati skupaj s konvencionalnim kromosomskim testom. Skrb za nosečnico ima pri tem postopku veliko vlogo. Pred analizo se mati, ki je pred porodom, poglobljeno pogovori o diagnostični metodi, ki razloži tveganja, možnosti in meje tehnologije.